蛋白質及其復合物、組裝體完整三維結構的測定,是研究生命活動中分子結構與功能之間關系,并揭示生命現(xiàn)象物理化學本質的科學基礎。目前,生命科學的主要目的是揭示基因組的功能,并在此基礎上闡明遺傳、發(fā)育、進化、功能調控等基本生物學問題,以及進一步解決與醫(yī)學、環(huán)境保護、農(nóng)業(yè)密切相關的問題。由于基因的功能最終將通過其表達產(chǎn)物即蛋白質來實現(xiàn),因此,要了解基因組全部功能活動(包括正常的和異常的),最終也必須回到蛋白質分子上來。蛋白質的主要功能則取決于其三維結構,目前,X射線晶體法是最常用的解析蛋白質三維結構的手段,該方法成功與否取決于是否可以得到高質量的蛋白質單晶。蛋白質結晶過程是蛋白質分子從無序變?yōu)橛行?從而從溶液中析出成為晶體的過程。由于蛋白質分子之間相互作用千差萬別、蛋白質晶體產(chǎn)生條件荀刻,導致大量與人類、植物等相關的重要蛋白質難以結晶,從而無法得知其結構并對其功能進行研究為了得到高質量的晶體,研究者致力于開發(fā)異質成核劑以促進蛋白質產(chǎn)生晶體并且已經(jīng)取得一定的成果,但是由于這些成核劑對蛋白質缺乏特異性親和能力,導致結晶實驗成功率低,且隨機性大。因此,開發(fā)一種與蛋白質具有高度親和性、普適的成核劑材料非常關鍵。

　　蛋白質磷酸化修飾是非常重要的一種蛋白質翻譯后修飾,迄今發(fā)現(xiàn)的所有蛋白質中超過50%均可被磷酸化修飾。蛋白質磷酸化作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式,幾乎與機體的所有生命活動有關,在控制細胞生存進程中起著關鍵作用,這些進程包括:細胞循環(huán)、生長、分化和凋亡等在植物體中,蛋白質的可逆磷酸化與植物抵抗外界環(huán)境脅迫有關,如抵抗病原菌侵害、抗寒、抗旱、抗鹽等。目前,對于植物的研究主要局限在模型植物擬南芥等特定激酵的憐酸化進程上作為自然界廣泛存在的生物,植物與人類的關系密不可分,磷酸化蛋白質組學領域的研究非常必要。然而蛋白質磷酸化是一個高度動態(tài)變化的過程,而且具有低化學計量、低豐度的特點,這些特點導致蛋白質磷酸化分析非常具有挑戰(zhàn)性。此外,由于植物細胞中含有大量的細胞壁等組織,以及植物葉片中大量存在的核酮糖等干擾物質,導致植物憐酸化蛋白質極難分離,從而給植物磷酸化蛋白質的研究造成很大障礙,因此,發(fā)展一種高效地植物憐酸化蛋白質分離手段非常重要已經(jīng)建立起來的磷酸化蛋白質/多肽富集方法主要分為三類,即免疫沉淀法、化學衍生法和親和色譜法,在這三類方法中,免疫沉淀法是用來富集磷酸化蛋白質,而另外兩種方法均是用來富集憐酸化多肽。免疫沉淀法是利用磷酸化蛋白質上的磷酸化殘基與抗體之間的特異性結合,從而將憐酸化蛋白質從樣品中分離出來的一種方法,利用這種方法,一些酪氨酸位點磷酸化的蛋白質被鑒定出來,例如等刺激因子。這種方法的最大缺點是,對于發(fā)生絲氨酸和蘇氨酸_酸化的蛋白質,因為得不到相應的抗體,幾乎沒有辦法富集,雖然現(xiàn)在也有一些通過該方法富集得到絲氨酸鱗酸化的蛋白質。

1.固定金屬離子親和色譜材料

　　1975年,首次在蛋白質分離中引入固定金屬離子親和色譜法(IMAC),并在隨后的研究中大力推進該方法的發(fā)展。在隨后的十年里,關于在蛋白質或者多肽分離中應用IMAC技術的文章數(shù)量飛速發(fā)展,目前,IMAC在磷酸化多肽領域的研究主要集中在兩個方面,一是IMAC材料的制備,二是吸附和解及附緩沖液的優(yōu)化。在IMAC材料的制備部分主要有三個關鍵點,即基質、整合基團、金屬離子,對于現(xiàn)有MAC材料各部分的選擇,亞氨基二乙酸和次氮基三乙酸的應用相對較廣,與之相對應的金屬離子為Fe3+和Ga3+,對于基質來說,瓊脂糖、纖維素、二氧化桂的應用較為廣泛,而且已經(jīng)有商品化的產(chǎn)品,但是大量實驗表明,以這些材料為基礎的IMAC在鱗酸化多肽的富集過程中,缺乏足夠的專一性,在富集磷酸化多肽的同時會吸附大量的酸性非磷酸化多肽(主要是含有大量梭基的多肽),為了避免這種非特異性吸附現(xiàn)象的發(fā)生,美國Viginia大學的White小組在采用IMAC對磷酸化多肽進行富集前,首先對樣品進行羧基的化反應,從而降低酸性非磷酸化多肽的吸附,但是由此帶來的副反應以及反應不完全均會對樣品造成污染,進而使得后續(xù)質譜檢測的靈敏度降低。除了將MAC制備成常規(guī)的小球外,復旦大學的原教授研究小組、軍事醫(yī)學科學院的錢小紅研究小組等將MAC做成帶有磁性的載體,基本原理是利ffiFe304@C材料,在其外殼改性并且固定金屬離子,從而得到具有磁性的IMAC,因為材料具有磁性,所以在分離時非常方便。

　　MAC材料制備之后,需要對其富集過程中釆用的緩沖液體系進行優(yōu)化,從而降低酸性非磷酸化多肽的非特異性吸附。已經(jīng)有研究表明緩沖液的組成、pH值的細微改變均會對最終的富集效果產(chǎn)生影響不僅在材料方面做了深入的研究,在緩沖液的選擇上也做了大量研究,在其對洗脫緩沖液體系進行優(yōu)化時,發(fā)現(xiàn)磷酸和乙腈的混合液可以取得非常好的洗脫效果。IMAC法不論是在材料還是在緩沖液的選擇性,近年來都取得了很大進展。

2.分子印跡材料

　　印跡材料的概念于1931年被Polyakov首次提出,但是直到20世紀80年代,關于分子印跡技術的研究依然處于空白期。分子印跡屬于超分子化學研究范疇,是指以某一特定的目標分子為模板,制備對該分子具有特異選擇性材料的過程,該技術被描述為可以識別“分子鋼匙”的“人工鎖”技術。分子印跡技術一般分為三個步驟:1)模板分子與功能單體在溶劑中通過共價或非共價相互作用形成穩(wěn)定的復合物;2)加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑,在紫外光或熱引發(fā)下發(fā)生聚合作用,使得模板分子周圍形成高度交聯(lián)的剛性聚合物;3)通過水解或萃取的方法將模板分子洗脫,從而在聚合物中留下了與模板分子的大小、形狀及功能基團相匹配的空穴。目前,全世界至少有包括瑞典、日本、德國、美國、中國等在內的幾十個國家、上百個學術機構和企事業(yè)團體在從事分子印跡材料的研究和開發(fā)。在過去的20年里,有關分子印跡技術的研究飛速發(fā)展,分子印跡技術的潛力被逐步挖掘出來,應用領域也越來越廣泛。分子印跡技術發(fā)展如此迅速,主要因為它有三大特點:構效預定性、特異識別性和廣泛適用性?；谠摷夹g制備的分子印跡材料具有親和性和選擇性高、抗惡劣環(huán)境能力強、穩(wěn)定性好、使用壽命長、應用范圍廣等特點,歐盟委員會早在1998年已經(jīng)啟動了一項專門自主歐洲8個研究小組從事印跡材料的制備、結構表征,以及分子印跡材料用于臨床分析、環(huán)境分析以及生物分析等方面的研究。

　　目前,分子印跡技術在小分子領域的應用已經(jīng)非常成熟,然而,對于復雜的生物大分子的研究依然匱乏,雖然已經(jīng)有研究報道將分子印跡技術應用到蛋白質、DNA、甚至病毒的研究上，但是在蛋白質、微生物細胞等生物大分子的應用上依然處于起步階段。按照合成方法進行分類,分子印跡聚合物可以分為以下幾類:本體聚合、懸浮聚合、沉淀聚合、表面分子印跡以及抗原印跡技術等。本體聚合是最為常見的一種分子印跡聚合物合成方法,合成時,將功能單體及模板分子溶解在同一種溶液中,交聯(lián)后對材料進行干燥、研磨、蹄分、模板分+洗脫,從而得到粒徑處于一定范圍的分+印跡聚合物。已經(jīng)被應用在毛細管屯泳、高效液相色譜以及薄層色譜中。但是由于通過該方法合成的分子印跡聚合物需要進行研磨,將導致產(chǎn)物顆粒不均一、人量高親和鍵合位點被破壞以及模板分-f洗脫不徹底的問題,因此大大限制了該方法的應fH。為了更好地應用分子印跡技術,許多其它的合成方法被建立。懸浮聚合是將模板分子、功能單體以及交聯(lián)劑溶解丁?有機溶劑中,然后移入水溶液中進行攪拌、乳化,之后引入引發(fā)劑引發(fā)聚合反應的發(fā)生,最后通過干燥、模板分子洗脫,可以得到粒徑相對均的多分散分子印跡聚合物。

　　表面分子印跡是指在分子印跡聚合物制備的過程中,將結合位點限在表面,模板分子的洗脫和再結合均發(fā)生在表面,因此非常適合對丁?生物大分子的印跡。通常,表面印跡是在微球載體表面進行修飾或涂層制備得到,制備過程中,功能單體與印跡分子在乳液界面處結合,交聯(lián)劑與單體聚合后,這種結合物結構就印在了聚合物的表面?？乖≯E技術是表面分子印跡技術的一種,是根據(jù)自然界中抗原與抗體之間特異性的相互作用而建立的一種方法,采用目標蛋白質分子暴露在表面的特征肽段(抗原決定基)作為模板分子,制備得到不僅可以識別模板分子,同時也可以識別以模板分子為特征部位的蛋白質分。該技術的引入為制備新型蛋白質分子印跡材料提供了新思路。

3.固定鈦離子親和色譜材料的制備及應用

　　蛋白質翻譯后修飾在蛋白質加工、成熟的過程中發(fā)揮著重要作用,它可以改變蛋白質的物理、化學性質,影響蛋白質的空間構象、立體位阻及穩(wěn)定性?？赡娴鞍踪|磷酸化是蛋白質翻譯后修飾中最為廣泛的一種,其在細胞代謝、增殖、分化、蛋白質降解、細胞信號傳導等生理過程的調控中發(fā)揮重要作用。在植物體內,可逆蛋白質憐酸化與植物抵抗外界環(huán)境脅迫有著密切關系,這些脅迫主要有生物或者非生物脅迫,如鹽脅迫、激素脅迫、溫度脅迫等等。對植物來說,鹽脅迫是最為廣泛的一種脅迫方式,有研究報道,在未來10年,鹽脅迫將影響50%的植物。為了抵抗外界環(huán)境的威脅,植物體已經(jīng)進化出一套高度精細的信號感知、傳導以及細胞反應網(wǎng)絡。在這個網(wǎng)絡中,可逆蛋白質磷酸化進程起到的關鍵的作用。在我國,玉米是一種主要的糧食作物,關于其抵抗外界鹽脅迫條件下的磷酸化蛋白質組學的研究,將有助于人們認清植物抵抗鹽脅迫的機理,并為開發(fā)抗鹽脅迫的品種提供理論依據(jù)。目前,在植物磷酸化蛋白質組學領域已經(jīng)取得一些進展,但是這些研究對象主要集中擬南芥、水稻等模式植物,鮮有關于玉米磷酸化蛋白質組學的研究報道。已有的關于玉米憐酸化蛋白質組學的研究,研究重點也僅局限在在玉米根系中特定蛋白質的研究上此外,這些研究主要釆用雙向電泳的手段研究憐酸化蛋白質,研究者需要投入大量的時間、精力、金錢完成研究工作。隨著質譜技術,以及以質譜技術為基礎的隣酸化蛋白質富集方法的發(fā)展,例如金屬氧化物親和色譜法(MOAC)、固定金屬離子親和色譜法(MAC),高通量的磷酸化蛋白質組學分析方法被應用在人體、動物疾病磷酸化蛋白質組學的研究中。

　　在眾多以質譜為基礎的憐酸化蛋白質富集方法中,MAC是一種快速、高效、經(jīng)濟的方法。2011年,Bi等采用金屬氧化物親和色譜法從正常的玉米葉中分離得到125種磷酸化蛋白質。然而,并沒有研究人員采用MOAC或者IMAC對鹽脅迫條件下的玉米憐酸化蛋白質組學進行研究。有研究表明,MOAC和MAC富集得到的憐酸化蛋白質/多肽的種類差異性很大,為了更加全面地了解鹽脅迫條件下玉米體內磷酸化進程,需要在玉米磷酸化蛋白質組學的研究中采用MAC的方法,這是因為越多憐酸化蛋白質的發(fā)現(xiàn),將會幫助研究者更好地理解玉米抵抗鹽脅迫的生理機制。

　　有研究表明,上樣緩沖液的組成對IMAC的富集效果有著重耍的影響。上樣緩沖液的組成、pH值等的微小改變都會造成結果的巨大差異。為了提高材料的特異性,上樣緩沖液的組成以及IMAC材料基質的選擇成為該領域研究的熱點。研究表明,一旦非磷酸多肽鍵合到IMAC材料上,將很難被去除。因此,從源頭,即上樣過程抑制非憐酸化多肽的鍵合非常關鍵。到目前為止,幾乎所有采用IMAC富集磷酸化多肽的研究中,都采用不同比例的乙腈和三氟,乙酸混合溶液作為上樣緩沖溶液。這是因為諸如三氟乙酸等的強酸可以使含有羧基的酸性多肽發(fā)生質子化,從而阻止這種酸性的磷酸化多肽鍵合到MAC材料上。在實驗室合成了一種固定鈦離子親和色譜材料,并對該材料所需的上樣緩沖溶液進行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)80%乙腈、6%三氟乙酸的緩沖溶液效果最佳。如此高比例的乙腈被應用是由于其可以降低MAC材料和非磷酸化多肽之間的疏水相互作用。同時,一些研究也表明在磷酸和乙腈的混合溶液中,改變其中乙腈的含量,磷酸溶液的pH值始終保持穩(wěn)定。研究表明采用不含乙腈的6%乙酸溶液(pH 3.5), IMAC材料富集磷酸化多肽的效果最。也有一些研究發(fā)現(xiàn),當上樣緩沖液中含有高濃度的有機酸,如2,5-二輕基苯甲酸或鄰苯二甲fe,可以極大地抑制結果中非憐酸化多肽的數(shù)量(Thingholm,2006; Larsen,2005)。這些研究表明當上樣緩沖液由高濃度的有機酸如鄰苯二甲酸氫鉀等組成時,固定金屬離子親和色譜或許將發(fā)揮最佳的效果。在前人的研究中,磷酸化修飾的殼聚糖和纖維素被用來作為合成MAC材料的基質材料,然后鐵離子被固定作為螯合憐酸化多肽的官能基團。然而,由于殼聚糖和纖維素不能溶解于水溶液中,因此如果在水相中對其進行磷酸化改性時,改性只能發(fā)生在表面,反應為非均相的反應。眾所周知,聚乙烯醇是一種高水溶性的生物相容性高分.1^物質,而且具有抗非特異性吸附的特點,因此很適合作為憐酸化多肽的富集材鑒于其的水溶性,其與憐酸的均相反應可以在水溶液中進行。另外,由于聚乙烯醇和磷酸反應可以生成凝膠狀的物質,因此產(chǎn)物擁有較大的比表面積,也就為后續(xù)鈦離子的固定提供了更多的位點。

4.固定沉淀劑分子印跡聚合物的應用

　　蛋白質及其復合物、組裝體完整三維結構的測定是研究生命活動中分子結構與功能關系,揭示生命現(xiàn)象的物理化學本質的科學基礎。蛋白質及其復合物晶體的X-射線衍射是研究生物大分子三維精細結構的最主要的手段之一。在人類基因組全序列測定順利完成和“后基因組時代”到來之際,生命科學的中心任務是揭示基因組的功能,并在此基礎上闡明遺傳、發(fā)育、進化、功能調控等基本生物學問題,以及進一步解決與醫(yī)學、環(huán)境保護、農(nóng)業(yè)密切相關的問題。由于基因的功能最終總是通過其表達產(chǎn)物-蛋白質來實現(xiàn)的,因此,要了解基因組全部功能活動(包括正常的和異常的),最終也必須回到蛋白質分子上來。

　　蛋白質是很多治療疾病藥物的作用目標,而蛋白質的主要功能則取決于其三維結構。目前,X-射線衍射法是最常用的解析蛋白質三維結構的手段,該方法成功與否取決于是否可以得到高質量的蛋白質單晶。蛋白質結晶過程是蛋白質分子從無序變?yōu)橛行?從而從溶液中析出成為晶體的過程。為了得到高質量的晶體,主要的手段是控制蛋白質結晶的成核階段,即蛋白質結晶過程的第一步。有研究表明,可以通過在亞穩(wěn)定狀態(tài)下引入異質成核劑達到誘導晶體產(chǎn)生的目的。目前,常用的異質成核劑主要有礦物質、人類毛發(fā)、娃等多孔材料、生物玻璃、沸石、聚合物材料。雖然,這些成核劑在一定程度上提高了晶體生長的幾率,但是由于其對蛋白質缺乏特異性親和能力,因此,這些成核劑的成功率低,且隨機性大。通過前面的幾章的介紹,了解到分子印跡聚合物(MIPS)由于在其合成過_中以待測目標分子或類似物作為模板,之后將該模板洗脫,從而在聚合物表面留有與模板分子完全吻合的空穴因此MIPS對目標分子具有高度地特異性親和能力,這種特質可能將有助于促進難以結晶的蛋白質產(chǎn)生晶體，在2011年,在蛋白質結晶中引入了 MIPs,由于 MIPs 的介入三種蛋白質結晶的成功率提高了 8-10%。在2012年,Reddy等對比了三種兩稀酰胺類的MIPs在蛋白質結晶實驗中的表現(xiàn),發(fā)現(xiàn)含有N-輕甲基丙烯酰胺的MIPs在蛋白質結晶實驗中效果最佳。

　　眾所周知,晶體生長的首要條件即是過飽和狀態(tài),在傳統(tǒng)的蛋白質結晶研究中,沉淀劑被用來幫助蛋白質達到過飽和狀態(tài),沉淀劑可以通過改變蛋白質-溶劑或者蛋白質-蛋白質之間的相互作用,從而有助于蛋白質分子更快的達到過飽和狀態(tài)。然而,許多重要的蛋白質含有多變的結構域以及連接體,這種多變的結構使得溶液中的蛋白質分子構象千差萬別,因此,這些蛋白質很難通過常規(guī)的結晶手段得到其高質量的單晶,從而難以充分認識其結構,并了解其作用。為了更好地促進結構靈活多變的重要蛋白質的結晶,在這部分的研究中,開發(fā)了另一種新型的分子印跡聚合物來幫助蛋白質晶體產(chǎn)生,在該聚合物中首次最常用的兩種沉淀劑,即將硫酸銨和聚乙二醇固定在了分子印跡聚合物中,此種新型的聚合物被命名為piMIPs,即固定沉淀劑分子印跡聚合物,并且按照其上固定沉淀劑種類的不同將其進一步命名為piMIPi(沉淀劑為聚乙二醇)

5.分子印跡薄膜的制備及應用

　　CHt是一種長壽命的溫室效應氣體,其在大氣中的濃度雖然極低,但對溫室效應的相對貢獻率卻達到15%,而且每年有遞增0.8%-1.0%的趨勢。就全球尺度而言,關于CRt的源主要是天然濕地、稻田、反當動物、化石燃料生產(chǎn)過程、垃圾處理及淺水湖沼。目前分離出的甲焼氧化菌幾乎都是專性氧化甲焼的,不能利用其他基質。在甲焼氧化菌的作用下,甲燒經(jīng)過一系列中間體甲醇、甲K、甲酸被氧化成二氧化碳,而甲燒氧化菌則從這些氧化途徑獲得能量,并利用中間產(chǎn)物甲醛作為唯一或主要的碳源供自身生長用。雖然土壤CH4氧化僅占全球CH4總匯的10%,但是,CHU氧化微生物在好氧-厭氧交界面處起到了限制土壤CH4向大氣排放的作用,因此也是大氣CRt的顯著的匯?！┭芯空咄ㄟ^比較好氧和嚴格厭氧條件下CH4排放量之間的差異,發(fā)現(xiàn)水稻田產(chǎn)生的CH4,平均有80%在排放到大氣中之前己被土壤中的甲燒氧化菌所氧化。據(jù)估計,土壤中的好氧甲焼氧化菌每年消耗掉30 Tg的CH4,因此，微生物消耗作用不僅限制了許多CH4源的排放量,而且也是大氣CH4的非常重要的匯。前對甲院氧化菌的研究主耍有兩種不同的途徑:第一個途徑是使傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術將甲院氧化菌分離后進行純培養(yǎng),然后對甲燒氧化歯進行生理生化遺傳學特征研究,針對甲焼氧化歯的獨立性狀進行菌體闡述,從而發(fā)現(xiàn)有特殊應W價值的甲焼氧化菌;第二種途徑不需富集培養(yǎng)甲燒氧化歯,主要是對甲綜氧化菌進行生態(tài)學研究,依靠PCR技術及甲綜氧化菌特異的進化和功能基因的DNA/RNA序列數(shù)據(jù)摔和PCR (多聚核U酸鏈式反應技術)技術在一起,使許多分子生態(tài)學手段可以直接應用于甲焼氧化菌的研究中,如PCR、16S rRNA、DGGE (變性梯度凝膠電泳技術)、PLFA (磷脂酸分析)、FISH (原位熒光染交法)等。通常認為通過富集培養(yǎng)方法,從純培養(yǎng)基中獲得到的甲焼氧化菌只是環(huán)境中甲燒氧化歯的一部分,并不能分離得到所有的甲焼氧化菌。